دانلود پایان نامه اپیدمیولوژی مولکولی پروتئینP2 غشای خارجی در هموفیلوس آنفلوانزا
دانشگاه آزاد اسلامی
واحد ارومیه
دانشكده علوم پایه گروه زیست شناسی
پایان نامه برای دریافت درجه كارشناسی ارشد
رشته زیست فناوری(بیوتكنولوژی) گرایش میكروبی
عنوان:
اپیدمیولوژی مولکولی پروتئینP2 غشای خارجی در هموفیلوس آنفلوانزا
استاد راهنما:
آقای دكتر سید داور سیادت
استاد مشاور:
آقای دكتر سید فضل الله موسوی
شهریور1393
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
فهرست مطالب
عنوان صفحه
1-2-مشخصات میکروسکوپی و ماکروسکوپی: 4
1-4-آنتی ژنها وعوامل بیماریزایی.. 5
1-4-1-عوامل اتصالی فیمبریه ای: 7
1-4-2-سایرعوامل بیماریزائی: 10
3-3-1- آماده سازی محیط کشت: 25
3-3-3- آماده سازی ژل اگارز 1 درصد: 27
3-8- نگهداری ایزوله‌های بالینی هموفیلوس آنفلوانزا در شرایط کرایو در دمای -80ْ: 29
3-9-1-استخراج DNA به روش جوشاندن: 30
3-10- بررسی کیفیت و کمیت DNAاستخراج شده: 30
3-11- راه اندازی و انجام PCR: 31
3-13- الکتروفورز محصول PCR: 35
3-13-1- مواد و وسایل مورد نیاز: 35
3-13-2- نحوه تهیه ژل اگارز و انجام الکتروفورز: 35
3-15-1- استخراج باند اصلی از روی ژل اگارز. 37
3-15-2- بررسی غلظت محصولات تخلیص شده توسط دستگاه نانودراپ: 37
3-16- مواد و وسایل لازم برای RFLP: 37
3-16-1- روش انجام RFLP باآنزیمAlu1: 38
3-16-2- انجامRFLP باآنزیم محدودالاثر EcoR1: 38
3-17- تعیین توالی و پردازش داده ها: 38
3-17-1- ارسال نمونهها جهت توالی یابی قطعه تکثیر شده: 39
فصل چهارم: تجزیه و تحلیل داده ها 40
4-1- تعداد نمونهها و ایزولاسیون: 41
4-3-نتایج بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده: 42
4-4- PCRژن ompP2 ایزوله‌های بالینی هموفیلوس آنفلوانزا: 43
4-6: نتایج تعیین توالی (Sequencing) و ثبت توالی‌ها دردیتابیسGeneBank/EMBL: 45
4-7- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی نمونه ها: 46
4-7-1- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 3: 46
4-7-2. آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 5: 47
4-7-3- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 8: 48
4-7-4- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 35: 49
4-7-5- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 47: 50
4-7-5- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره14: 51
4-8- بررسی میزان شباهت و تفاوت ایزوله‌های بالینی تهران: 52
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری.. 56
5-1- آنالیز RFLP از ایزوله‌های بالینی: 57
5-2. آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 3: 57
5-2-1آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 5: 58
5-2-2- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 8: 58
5-2-3- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 35: 59
5-2-4- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 14: 60
5-2-5- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 47: 60
فهرست جداول
جدول3-1- مواد تشکیل دهنده و مقدار حجم آنها برای PCRاز ompP2. 34
جدول 3-2- برنامه PCR برای تکثیر ژن ompP2. 34
جدول3-3- توالی پرایمرهای مورد استفاده برای ompP2. 35
جدول 4-1- اطلاعات نمونه‌های دریافتی از بیماران مورد مطالعه. 41
جدول 4-2 نتایج بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده 42
جدول 4-3- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 3 در NCBI 47
جدول 4-4- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 5 در NCBI 48
جدول 4-5- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 8 در NCBI 49
جدول 4-6- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 35 در NCBI 50
جدول 4-7- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 47 در NCBI 51
جدول 4-8-. نتیجهBlast سکانس اسید نوکئیک شماره 14 در NCBI 52
فهرست اشکال
شکل1-1- ساختارشیمیایی پلی ریبوزیل ریبیتول فسفا ت… 3
شکل1-3- کلو نی‌های هموفیلو س آنفولانزا روی محیط شکلات اگار. 5
شکل 3-2- شکل باسیل گرم منفی هموفیلوس آنفلوانزا 30
شکل 3-3- دستگاه ترموسایکلر. 34
شکل 3-4- دستگاه الکتروفورز. 36
شکل4-1- ژن ompP2 ایزوله‌های با لینی… 43
شکل 4-2و4-3- جایگاه برش آنزیم محدودالاثر Alu1برای ژنompP2 ایزوله‌های بالینی… 44
شکل 4-4- جایگاه برش آنزیم محدودالاثر ECOR1برای ژن ompP2ایزوله‌های بالینی… 44
شکل 4-5- کروماتوگرام به دست آمده از تعیین توالی ژن ompP2 نمونه شماره 14با پرایمر Forward.. 45
شکل 4-6- کروماتوگرام به دست آمده از تعیین توالی ژن ompP2نمونه شماره 14با پرایمر Revers. 45
شکل 4-8- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 3.. 46
شکل 4-10- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 5.. 47
شکل 4-12- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 8.. 48
شکل 4-14- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 35.. 49
شکل 4-16- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 47.. 50
شکل 4-18- نواحی حفاظت شده پروتئین شماره 14.. 51
شکل 4-19- مقایسه ساختمانی اسیدآمینه پروتئینP2 ایزوله‌های بالینی با همدیگر. 54
فهرست نمودارها
نمودار 4-2- میزان درصد هر یک از الگو ها 53
چکیده:
هموفیلوس آنفلوانزا،یک باکتری گرم منفی و پاتوژن اختصاصی انسانی است که از نظر بیماری زایی میتواند ایجاد مننژیت حاد باکتریایی ،سپتی سمی،اپی گلوتیت،باکتریمی،عفونت گوش میانی کند. هدف این مطالعه بررسی یکی از این پروتئین ها ی حفاظت شده در باکتری هموفیلوس آنفلوانزا به منظور طراحی واکسن بومی علیه ان می‌باشد. پروتئینP2 ، بین 38 الی 40 كیلودالتون وزن داشته و بیش از 50 درصد كل پروتئینهای غشاء خارجی هموفیلوس را شامل میگردد و غالبا توسط سویههای فاقدكپسول و سویه b هموفیلوس ها بیان میشود.
این پروتئین به عنوان یک کاندیدای مناسب واکسن برای سویههای بدون کپسول هموفیلوس آنفلوانزا مطرح است. در این تحقیق ،اپیدمیولوژی ژن ompP2 با بهره گرفتن از نمونه‌های بالینی که از 30 بیمار جداسازی شده بودند،مورد بررسی قرار گرفت. باکتری ها در محیط شکلات اگار کشت داده شدند و تستهای بیوشیمیایی انها انجام شد. پس از تخلیص DNA،واکنش PCR انجام شد. همه نمونه ها از نظر وجود ژن ompP2) 1173(bp مثبت شدند. پس از تعیین توالی 6 نمونه و مقایسه توالی ژن ompP2 سویههای بومی با سویههای استاندارد و توالی موجود در بانک ژنی،با نرم افزار MEGA4 ،شباهت ها و تفاوت های ناشی از حذف ،اضافه و یا جابه جایی نوکلئوتیدی را نشان داد. جهت بررسی الگوی پلی مورفیسم ژن مورد نظر ،محصول PCR مورد هضم توسط آنزیم های Alu1 و EcoR1 قرار گرفتند. الگوی برش 21 نمونه (99%-98%) مشابه سویههای استاندارد باno:J3359. 1,M93268. 1,M93269. 1,M932701) (accessionبود و 9 نمونه (98%-91%) متفاوت بود. نتایج ما نشان دادکه ژن ompP2 از نظر سازماندهی ژنی،شبیه سویههای مختلف هموفیلوس آنفلوانزا ثبت شده در بانک ژنی است و در قسمت برش توسط آنزیم محدودالاثر Alu1دچار پلی مورفیسم شدند. لذا این پروتئین میتواند کاندید مناسبی برای واکسن باشد.
واژگان کلیدی: هموفیلوس آنفلوانزا،واکسن،ژن ompP2،PCR.
فصل اول:
کلیات
هموفیلوس آنفولانزا اولین بار در پاندمی ویروس آنفولانزا توسط فایفر[1] در سال 1892 معرفی شد ( (Murley et al, 1988 (Reddy et al, 1996. فایفر گزارش کرد در نمونه خلط بیماران مبتلا به آنفولانزا یک باکتری ناشناخته مشاهده شده، که نام آن را باسیل فایفر گذاشت و تا چندین سال تصور بر این بود که این باکتری عامل بیماری آنفولانزا است به همین خاطر به آن آنفولانزا نیز میگفتند. بعدها مشخص شد که این باکتری به عنوان یک عفونت ثانویه در دستگاه تنفسی مبتلایان به ویروس آنفولانزا مطرح است (Peltola H, 2000). چهل سال بعد از فایفر، پیتمن[2] نشان داد که هموفیلوس آنفولانزا میتواند به دو دسته کپسولدار و بدون کپسول تقسیم شود. وی شش تایپ پلی ساکارید کپسولی از این باکتری را بر مبنای خاصیت آنتی ژنیک آنها معرفی کرد که کپسول آنها مسئول ویرولانس ارگانیسم است. ساختار این کپسولها بعدها شناسایی شد. این شش تایپ راa تاf نامیدند (;Cotter D et al, 2002 ;Murley et al, 1998 (Murphy et al, 1993; Reddy et al, 1996 . (از بین این شش سروتایپ کپسولدار، سروتایپ b هموفیلوس آنفولانزا (Hib) تقریبا در 90 درصد موارد ابتلا، اصلیترین عامل مننژیت باکتریایی در کودکان زیر 5 سال، عامل 95 درصد بیماریهای مهاجم دیگری همچون باکتریمی، پنومونی و سپتی سمی در کودکان و مسئول نیمی از بیماریهای مهاجم بزرگسالان همچون سلولیت، اپیگلوتیت، لارنژیت و ارتریت چرکی می‌باشد (;Haase et al, 1994 (Murphy et al, 1993.
پیتمن همچنین مشاهده کرد که تمام سویههای جدا شده از مایع نخاعی و خون بیماران از تایپ b کپسولدار است (Reddy et al, 1996). عفونت سیستمی‌در کودکان توسط گونههای این باکتری در سراسر دنیا اتفاق میافتد و میزان شیوع آسیبهای نورولوژیک، این باکتری را به یک نگرانی عمومی برای سلامت افراد تبدیل کردهاست (; Haase et al, 1994 ( Murley et al, 1998.این باکتری توسط کپسول پلیساکاریدی از جنس قند پنج کربنه (پنتوز) که پلیمری از واحدهای تکراری پلی ریبوزیل ریبیتول فسفات [3] (PRP)می‌باشد، از فاگوسیتوز توسط ماکروفاژها محافظت میگردد (Reddy et al, 1996) ; Kubiet&Ramphal, 1995) .).
تعداد صفحه : 129
قیمت :14700 تومان
بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد
و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.
پشتیبانی سایت : * serderehi@gmail.com
در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.
[add_to_cart id=151636]